Produksi Etanol Menggunakan Saccharomyces Cerevisiae Yang Diamobilisasi Dengan Agar Batang

Dalam proses produksinya, melewati 10 prosedur tahapan kerja :

1. Regenerasi Khamir

Biakan murni S. cerevisiae diremajakan pada agar miring (media YGA) yang telah disterilisasi pada suhu 121 oC dan tekanan 1 atm selama 15 menit, selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 oC selama 48 jam. Saccharomyces cerevisiae pada media YGA ini menjadi stok kultur yang diregenerasi pada media YGA yang baru sebelum digunakan.

2. Pembiakan untuk Memperoleh Biomassa S. cerevisiae

Satu ose Saccharomyces cerevisiae dari YGA miring diinokulasi pada 10 mL media kompleks dan diinkubasi pada suhu 30 oC selama 20 jam dengan dishaker 100 rpm. Kemudian, starter ini di pindahkan ke 90 mL media kompleks dan diinkubasi pada kondisi yang sama. 100 mL starter ini selanjutnya di pindahkan lagi ke dalam 900 mL media kompleks dan diinkubasi pada suhu 30 oC dan dishaker 100 rpm.  Selama inkubasi, pertambahan biomassa diamati dan dihentikan pada saat pertumbuhan S. cerevisiae memasuki   pertengahan fase log (±  20 jam) dengan cara disimpan dalam lemari es pada suhu 4-10oC. (Hadioetomo, 1983)

Pada saat sel akan digunakan, sejumlah volume tertentu cairan stok biomassa ini disentrifuga pada 6000 rpm selama 30 menit untuk  memisahkan  sel  dari  media  cair. Supernatan  dipisahkan  dari  sel  basah  dengan cara dekantasi . Sel basah yang diperoleh selanjutnya akan digunakan untuk fermentasi dalam keadaan bebas dan eramobil. (Goksungur, Y. dan Zorlu, N, 2001)

3.  Optimasi Konsentrasi Agar batang

Sel yang akan diamobil diambil dari 80 mL cairan stok biomassa dengan cara yang telah dijelaskan sebelumnya. Sel basah yang diperoleh ditambah aquades steril sampai 8 mL dan dibagi empat, masing-masing 2 mL. Agar batang sebanyak 0,1; 0,2; 0,3 dan 0,4 g masing-masing dilarutkan dalam     aquades yang sudah mendidih sambil di stirer sampai larut dan ditepatkan volumenya sampai 8 mL. Larutan tersebut diturunkan suhunya sampai kira-kira 40 oC dan masing-masing dicampur dengan 2 mL suspensi sel basah yang telah disiapkan sebelumnya  dalam  cawan  petri,  sehingga diperoleh  larutan  agar  batang  yang berkonsentrasi  1, 2, 3 dan  4 % (b/v).   Semua larutan diaduk hingga homogen dan dibiarkan selama satu malam dalam lemari es. Gel yang terbentuk dipotong  5 x 5 mm dan dicuci dengan larutan NaCl 0,85 % (b/v) untuk menghilangkan sel  yang  tidak  terperangkap.  Jumlah  sel  yang lepas ditentukan dengan metode cawan tuang. Setiap sel amobil kemudian digunakan dalam fermentasi  menggunakan  100  mL  media kompleks  selama    48  jam  pada  suhu  30oC . Selanjutnya semua cairan fermentasi disentrifuga dan   supernatannya   didestilasi.   Kadar   etanol dalam masing-masing destilat diukur dengan kromatogafi   gas.       Konsentrasi   agar   batang optimal adalah yang menghasilkan etanol terbanyak. Sel yang teramobil dalam agar batang diketahui  dengan  cara  mengurangi  jumlah  sel yang digunakan dalam amobilisasi dengan jumlah sel yang lepas.

4.   Optimasi pH

Pengaruh pH terhadap kadar etanol yang dihasilkan dari fermentasi dengan sel amobil dilakukan pada 5 x 100 mL media kompleks dengan variasi pH  3,6; 3,9; 4,2; 4,5 dan 4,8. Sel amobil  yang  digunakan  dibuat  dengan konsentrasi agar batang optimal yang telah diketahui sebelumnya dengan cara dan jumlah yang sama (gel dari 10 mL larutan agar batang 2 % untuk 100 mL media fermentasi). pH awal media fermentasi diatur menggunakan HCl 10 %. Fermentasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 30oC. pH optimal media fermentasi adalah yang memberikan kadar etanol terbesar.

5.  Optimasi Konsentrasi Glukosa

Konsentrasi   glukosa   dalam   100   mL media kompleks (dengan pH optimal) dibuat bervariasi (8; 10; 15; 20; dan 25 %). Sel amobil dengan konsentrasi agar batang dan pH optimal digunakan dalam fermentasi selama 48 jam pada suhu 30 oC.  Selanjutnya semua cairan fermentasi disentrifuga dan supernatannya didestilasi. Kadar etanol masing-masing destilat diukur dengan kromatogafi gas. Konsentrasi glukosa optimal adalah konsentrasi glukosa pada media yang memberikan kadar etanol terbesar.

6. Fermentasi dengan Sel Bebas untuk Memperoleh  Pola  Konsumsi  Glukosa  dan Produksi Etanol

80 mL cairan stok biomassa disentrifuga pada  6000  rpm  selama  30  menit. Supernatannya didekantasi dan sel bebas yang diperoleh digunakan dalam fermentasi menggunakan 800 mL media kompleks optimal (dengan  pH  dan  konsentrasi  glukosa  optimal) pada  suhu  30  oC.  Cairan  fermentasi  sebanyak 105 mL diambil sebagai sampel setiap 6-12 jam. Sampel disentrifuga selama 30 menit pada 6000 rpm dan supernatannya didekantasi.    1 mL supernatan   sampel   digunakan   untuk   analisis kadar glukosa dengan metode Smogy-Nelson dan 100 mL didestilasi dan dianalisis kadar etanolnya.

7. Fermentasi dengan Sel Amobil untuk Memperoleh  Pola  Konsumsi  Glukosa  dan Produksi Etanol

80 mL cairan stok biomassa disentrifuga pada  6000  rpm  selama  30  menit. Supernatannya didekantasi dan sel bebas yang diperoleh diamobilisasi dalam agar batang 2% dengan cara yang telah dijelaskan sebelumnya. Semua sel amobil selanjutnya digunakan dalam fermentasi  menggunakan  800  mL  media kompleks pada kondisi optimal dan suhu 30 oC. Cairan   fermentasi   sebanyak   105   mL  diambil sebagai sampel setiap 6-12 jam. Sampel disentrifuga selama 30 menit pada 6000 rpm dan supernatannya didekantasi. 1 mL supernatan sampel digunakan untuk analisis kadar glukosa dengan metode Smogy-Nelson dan 100 mL didestilasi dan dianalisis kadar etanolnya.

8.  Uji Perulangan

Untuk mengetahui pengaruh perulangan penggunaan  sel  amobil  terhadap  kadar  etanol yang dihasilkan, sel amobil (agar batang 2 %) digunakan berulang dalam fermentasi menggunakan media kompleks pada kondisi optimal  dan  suhu  30  oC selama  waktu  optimal (dilihat  dari  kurva  etanol  sebagai  fungsi  waktu yang telah diperoleh sebelumnya). Setelah fermentasi  pertama  selesai,  sel  amobil dipisahkan dengan cara disaring dan langsung dimasukkan  ke  dalam  media  fermentasi  yang baru untuk fermentasi  berikutnya dengan kondisi yang sama.  Perlakuan ini diulangi sebanyak lima kali dan dianalisis kadar etanol yang dihasilkan pada setiap perulangan fermentasi. 

9. Uji    Durabilitas    Sel    Amobil    terhadap Penyimpanan

Untuk mengetahui durabilitas sel amobil terhadap waktu penyimpanan, empat cawan petri sel amobil (setiap cawan berisi sel amobil dalam 10 mL agar batang 2 %) digunakan dalam fermentasi setelah disimpan masing-masing selama   0,   3,   6   dan   9   hari.   Penyimpanan dilakukan tanpa media apapun dalam lemari es dengan suhu 4-10 oC. Fermentasi dilakukan menggunakan media kompleks optimal selama waktu optimal pada suhu 30oC. Setiap hasil fermentasi dianalisis kadar etanolnya untuk mengetahui durabilitas sel amobil dalam menghasilkan etanol setelah disimpan selama waktu tertentu.

10  Metode Analitik

Untuk menganalisis kadar etanol, sampel cairan fermentasi disentrifuga pada 6000 rpm selama 30 menit. Supernatannya didestilasi pada suhu 78–80oC menggunakan peralatan destilasi vigreux. Kadar etanol dalam destilat ditentukan dengan   kromatografi   gas   Shimadzu   GC-14B (kolom CBP-10 medially polar, detektor FID, integrator Shimadzu C-R6A Chromatopac). Temperatur oven dan kolom diatur pada 180oC dan temperatur injektor dibuat pada 250oC. Konsentrasi glukosa ditentukan dengan metode Smogy-Nelson.   Jumlah   sel   ditentukan   dengan metode turbidimetri menggunakan spektronik 20D pada 620 nm dan cawan tuang.