Produksi Etanol Menggunakan Saccharomyces Cerevisiae Yang Diamobilisasi Dengan Agar Batang

Alat :
1.    fermentor sistem batch untuk fermentasi.
2.    cawan petri dan tabung reaksi untuk penumbuhan bakteri pada media padat dan cair.
3.    laminary air flow sebagai ruang steril untuk pembuatan media pemindah biakan dan amobilisasi sel.
4.    autoclave untuk sterilisasi basah pada tekanan 1 atm dan suhu 121 C.
5.    Inkubator dan rotary shaker digunakan untuk inkubasi biakan.
6.    sentrifuga untuk pemisahan cairan fermentasi dan pemanenan bakteri.
7.    Peralatan destilasi vigreux untuk pemisahan (pemekatan) etanol.
8.    kromatografi gas GC-14B-SHIMADZU untuk analisis etanol.
9.    spektronik 20D untuk pengukuran densitas optik suspensi sel dan analisa kadar glukosa.
10.    serta peralatan gelas dan peralatan tambahan lainnya yang lazim digunakan dalam laboratorium kimia.
Bahan :
1.    Khamir Saccharomyces cerevisiae strain tahan alkohol tinggi.
2.    Media (YGA) Yeast Glucose Agar (merck) dengan komposisi YGA terdiri atas glukosa 2 %, bacto agar 2 %, pepton 1 % dan yeast extract 0,5 %.
3.    Media kompleks untuk starter dan uji fermentasi awal terdiri atas glukosa 8 %, yeast extract 0,1 %, KH2PO4 0,2 %, (NH4)2SO4 0,4 % dan MgSO4.7H2O 0,1 % (merck).
4.    Media minimal untuk starter dan uji fermentasi awal (Vullo dan Wachsman, 2005) terdiri atas glukosa 8 %, KH2PO4 0,2 %, (NH4)2SO4 0,4 % dan MgSO4.7H2O 0,1 % (merck).
5.    Agar batang.
6.    Larutan NaCl 0,85 % untuk mencuci gel dari sel yang tidak teramobil.
Prosedur Kerja :
•    Regenerasi Khamir
1.    Biakan murni S. cerevisiae diremajakan pada agar miring (media YGA) yang telah disterilisasi pada suhu 121 oC dan tekanan 1 atm selama 15 menit, selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 oC selama 48 jam.
2.    Saccharomyces cerevisiae pada media YGA ini menjadi stok kultur yang diregenerasi pada media YGA yang baru sebelum digunakan.
•    Pembiakan untuk Memperoleh Biomassa S. Cerevisiae
1.    Sebanyak satu ose Saccharomyces cerevisiae dari YGA miring diinokulasi pada 10 mL media kompleks dan diinkubasi pada suhu 30 oC selam 20 jam dengan dishaker 100 rpm.
2.    Setelah 20 jam, starter ini di pindahkan ke 90 mL media kompleks dan diinkubasi pada kondisi yang sama.
3.    100 mL starter ini selanjutnya di pindahkan lagi ke dalam 900 mL media kompleks dan diinkubasi pada suhu 30 oC dan dishaker 100 rpm.
4.    Selama inkubasi, pertambahan biomassa diamati dan dihentikan pada saat pertumbuhan S. Cerevisiae memasuki pertengahan fase log (± 20 jam) memasuki pertengahan fase log (± 20 jam) 4-10 oC.
5.    Pada saat sel akan digunakan, sejumlah volume tertentu cairan stok biomassa ini disentrifuga pada 6000 rpm selama 30 menit untuk memisahkan sel dari media cair.
6.    Supernatan dipisahkan dari sel basah dengan cara dekantasi.
7.    Sel basah yang diperoleh selanjutnya akan digunakan untuk fermentasi dalam keadaan bebas dan teramobil.
•    Optimasi Konsentrasi Agar Batang
1.    Sel yang akan diamobil diambil dari 80 mL cairan stok biomassa dengan cara yang telah dijelaskan sebelumnya.
2.    Sel basah yang diperoleh ditambah aquades steril sampai 8 mL dan dibagi empat, masing-masing 2 mL.
3.    Agar batang sebanyak 0,1; 0,2; 0,3 dan 0,4 g masing-masing dilarutkan dalam aquades yang sudah mendidih sambil di stirer sampai larut dan ditepatkan volumenya sampai 8 mL.
4.    Larutan tersebut diturunkan suhunya sampai kira-kira 40 oC dan masing-masing dicampur dengan 2 mL suspensi sel basah yang telah disiapkan sebelumnya dalam cawan petri, sehingga diperoleh larutan agar batang yang berkonsentrasi 1, 2, 3 dan 4 % (b/v).
5.    Semua larutan diaduk hingga homogen dan dibiarkan selama satu malam dalam lemari es.
6.    Gel yang terbentuk dipotong 5 x 5 mm dan dicuci dengan larutan NaCl 0,85 % (b/v) untuk menghilangkan sel yang tidak terperangkap.
7.    Jumlah sel yang lepas ditentukan dengan metode cawan tuang. Setiap sel amobil kemudian digunakan dalam fermentasi menggunakan 100 mL media kompleks selama 48 jam pada suhu 30 oC .
8.    Selanjutnya semua cairan fermentasi disentrifuga dan supernatannya didestilasi.
9.    Kadar etanol dalam masing-masing destilat diukur dengan kromatogafi gas.
•    Optimasi pH
1.    Pengaruh pH terhadap kadar etanol yang dihasilkan dari fermentasi dengan sel amobil dilakukan pada 5 x 100 mL media kompleks dengan variasi pH 3,6; 3,9; 4,2; 4,5 dan 4,8.
2.    Sel amobil yang digunakan dibuat dengan konsentrasi agar batang optimal yang telah diketahui sebelumnya dengan cara dan jumlah yang sama (gel dari 10 mL larutan agar batang 2 % untuk 100 mL media fermentasi).
3.    pH awal media fermentasi diatur menggunakan HCl 10 %.
4.    Fermentasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 30 oC.

•    Optimasi Konsentrasi Glukosa
1.    Konsentrasi glukosa dalam 100 mL media kompleks (dengan pH optimal) dibuat bervariasi (8; 10; 15; 20; dan 25 %).
2.    Sel amobil dengan konsentrasi agar batang dan pH optimal digunakan dalam fermentasi selama 48 jam pada suhu 30 oC.
3.    Selanjutnya semua cairan fermentasi disentrifuga dan supernatannya didestilasi.
4.    Kadar etanol masing-masing destilat diukur dengan kromatogafi gas.
•    Fermentasi dengan Sel Bebas untuk Memperoleh Pola Konsumsi Glukosa dan Produksi Etanol
1.    80 mL cairan stok biomassa disentrifuga pada 6000 rpm selama 30 menit.
2.    Supernatannya didekantasi dan sel bebas yang diperoleh digunakan dalam fermentasi menggunakan 800 mL media kompleks optimal pada suhu 30 oC.
3.    Cairan fermentasi sebanyak 105 mL diambil sebagai sampel setiap 6-12 jam.
4.    Sampel disentrifuga selama 30 menit pada 6000 rpm dan supernatannya didekantasi.
5.    1 mL supernatan sampel digunakan untuk analisis kadar glukosa dengan metode Smogy-Nelson dan 100 mL didestilasi dan dianalisis kadar etanolnya.
•    Fermentasi dengan Sel Amobil untuk Memperoleh Pola Konsumsi Glukosa dan Produksi Etanol
1.    80 mL cairan stok biomassa disentrifuga pada 6000 rpm selama 30 menit.
2.    Supernatannya didekantasi dan sel bebas yang diperoleh diamobilisasi dalam agar batang 2% dengan cara yang telah dijelaskan sebelumnya.
3.    Semua sel amobil selanjutnya digunakan dalam fermentasi menggunakan 800 mL media kompleks pada kondisi optimal dan suhu 30 oC.
4.    Cairan fermentasi sebanyak 105 mL diambil sebagai sampel setiap 6-12 jam.
5.    Sampel disentrifuga selama 30 menit pada 6000 rpm dan supernatannya didekantasi.
6.    1 mL supernatan sampel digunakan untuk analisis kadar glukosa dengan metode Smogy-Nelson dan 100 mL didestilasi dan dianalisis kadar etanolnya.
•    Uji Perulangan
1.    Untuk mengetahui pengaruh perulangan penggunaan sel amobil terhadap kadar etanol yang dihasilkan, sel amobil (agar batang 2 %) digunakan berulang dalam fermentasi menggunakan media kompleks pada kondisi optimal dan suhu 30 oC selama waktu optimal.
2.    Setelah fermentasi pertama selesai, sel amobil dipisahkan dengan cara disaring dan langsung dimasukkan ke dalam media fermentasi yang baru untuk fermentasi berikutnya dengan kondisi yang sama.
3.    Perlakuan ini diulangi sebanyak lima kali dan dianalisis kadar etanol yang dihasilkan pada setiap perulangan fermentasi.
•    Uji Durabilitas Sel Amobil terhadap Penyimpanan
1.    Untuk mengetahui durabilitas sel amobil terhadap waktu penyimpanan, empat cawan petri sel amobil (setiap cawan berisi sel amobil dalam 10 mL agar batang 2 %) digunakan dalam fermentasi setelah disimpan masing-masing selama 0, 3, 6 dan 9 hari.
2.    Penyimpanan dilakukan tanpa media apapun dalam lemari es dengan suhu 4-10 oC.
3.    Fermentasi dilakukan menggunakan media kompleks optimal selama waktu optimal pada suhu 30 oC.
4.    Setiap hasil fermentasi dianalisis kadar etanolnya untuk mengetahui durabilitas sel amobil dalam menghasilkan etanol setelah disimpan selama waktu tertentu.
•    Metode Analitik
1.    Untuk menganalisis kadar etanol, sampel cairan fermentasi disentrifuga pada 6000 rpm selama 30 menit.
2.    Supernatannya didestilasi pada suhu 78–80 oC menggunakan peralatan destilasi vigreux.
3.    Kadar etanol dalam destilat ditentukan dengan kromatografi gas Shimadzu GC-14B (kolom CBP-10 medially polar, detektor FID, integrator Shimadzu C-R6A Chromatopac).
4.    Temperatur oven dan kolom diatur pada 180 oC dan temperatur injektor dibuat pada 250 oC.
5.    Konsentrasi glukosa ditentukan dengan metode Smogy-Nelson.
6.    Jumlah sel ditentukan dengan metode turbidimetri menggunakan spektronik 20D pada 620 nm dan cawan tuang.

Sumber : Asga Elevri, P. Surya Rosa Putra. 2006. “Produksi Etanol Menggunakan Saccharomyces Cerevisiae Yang Diamobilisasi Dengan Agar Batang”. Laboratorium Biokimia, jurusan Kimia FMIPA ITS.